Introducción

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Las infecciones causadas por las especies de Candida han aumentado en las últimas décadas, especialmente las infecciones fúngicas del torrente sanguíneo y otras sistémicas¹. Este incremento es debido al mayor número de paciente hospitalizados que presentan alguna deficiencia en el sistema inmunitario como en neonatos prematuros, al uso generalizado de antibioticoterapia de amplio espectro, al incremento de procedimientos invasivos y dispositivos, al creciente número de pacientes con neoplasias y trasplantes entre otros². Las especies del género Candida constituyen en orden de frecuencia el cuarto grupo más común de agentes causantes de infecciones nosocomiales del torrente sanguíneo³. Se calcula que en Estados Unidos y Europa la frecuencia de candidemia está entre 5 al 8%⁴. En un estudio realizado en América Latina en siete paises la candidemia se encontró en el 26,5%; hubo una gran variabilidad en la distribución de especies en los diferentes países. Ecuador tuvo la mayor proporción de episodios por C. albicans (52,2%) y Honduras y Venezuela la más baja (27,4% y 26,8%, respectivamente)⁵. Ecuador en el mismo estudio arrojó una incidencia general de 0,9 casos por 1.000 admisiones⁵. Sin embargo es difícil estimar la real incidencia de la candidemia debido a que los estudios arrojan datos distintos dependiendo de la población estudiada y difiere muchos en diversas zonas geográficas de un mismo país⁶.

C. albicans es la especie más frecuente, sin embargo, las especies no albicans representan una preocupación creciente en la epidemiología⁷. Varios informes definen a la especie de C. parapsilosis como el segundo aislamiento más frecuente de infecciones del torrente sanguíneo, especialmente en Ecuador y el resto de América Latina⁵.

Candida parapsilosis es miembro de la flora cutánea comensal. El complejo Candida parapsilosis, se conoce también como Candida senso lato. En este estudio utilizaremos en término complejo Candida parapsilosis. Su papel como patógeno oportunista humano no difiere notablemente de las otras infecciones por Candida sin embargo, hay que señalar que es un patógeno importante en recién nacidos con bajo peso al nacer, pacientes bajo esquemas de hiperalimentación intravenosa, individuos oncohematológicos y pacientes ingresados en cuidados intensivos y unidades de quemados¹. Los dispositivos médicos invasivos, como vías centrales u otras prótesis, representan el principal sustrato de colonización y siembra profunda para esta especie, debido a su capacidad innata para formar biopelículas en superficies orgánicas o inorgánicas como en el caso de otitis que requieren cirugía de colocación de tubos en el oído (timpanostomía)⁸. C. parapsilosis es capaz de colonizar materiales inertes y sobrevivir en el medio ambiente por mucho tiempo, lo que permite la propagación intrahospitalaria y la transmisión de paciente a paciente a través de las manos de los trabajadores de la salud, por lo que es una causa importante de brotes⁵.

A estas particularidades, se suma el aumento en las tasas de resistencia a antifúngicos en la mayoría de las infecciones por hongos y en C. parapsilosis en particular, situación por la que se reducen las opciones terapéuticas⁹ y más aún en el Ecuador donde la disponibilidad de antifúngicos para infecciones invasivas es muy limitada¹⁰.

El complejo C. parapsilosis se divide en tres grupos, denominados I, II y III, debido a diferencias genéticas pues fenotípicamente son prácticamente indistinguibles, pero en año 2005, Tavanti et al.¹¹ demostraron que la Candida parapsilosis estaba compuesta por tres especies crípticas y propuso la nomenclatura actual: C. parapsilosis sensu estricto, Candida ortopsilosis y Candida metapsilosis¹¹. Cuando las especies son muy parecidas entre sí y con los métodos convencionales no se pueden establecer diferencias pasan a ser agrupadas en un complejo. Así por ejemplo complejo Enterobacter cloacae, o el complejo Burkholderia cepacia. Varios estudios previos llegaron a sugerir que podrían tratarse de especies distintas. Hasta llegar a definir estas diferencias se realizaron varios estudios con base en las diferencias observadas mediante el análisis de la amplificación al azar del ADN polimórfico (RAPD), el análisis de la región ITS y de las secuencias de los dominios D1/D2 del ARNr (ácido ribonucleico ribosomal)¹² hasta que mediante la tipificación multilocus de secuencias (Multilocus sequence typing; MSLT) Tavanti et al., concluyeron que las secuencias de los 3 grupos diferían al mismo nivel que lo hacían distintas especies, razón por la que finalmente se designaron como tres especies distintas¹³.

Para la identificación correcta de las especies de este complejo, se han utilizado varios ensayos fenotípicos para identificar el complejo C. parapsilosis, pero no distinguen con precisión sus tres especies crípticas, por lo que requieren el uso de métodos moleculares para la diferenciación como polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), PCR en tiempo real, PCR con cebadores específicos, espectrometría de masas por ionización y desorción láser asistida por matriz (MALDITOF), y análisis de secuenciación. Todas estas metodologías presentan sus limitaciones debido a que no logran diferenciar entre especies C. orthopsilosis y C. metapsilosis¹¹.

Por lo que la construcción de árboles filogenéticos a partir de secuencias de ADN ha facilitado la identificación de especies de hongos, siendo la región ITS la más utilizada siendo considerada como el código de barras universal para los hongos debido a la facilidad de amplificación y su amplia utilidad en todo el reino. La filogenética se basa en información extraída de material genético como el ácido desoxirribonucleico (ADN), el ácido ribonucleico (ARN) o secuencias de proteínas para la construcción de árboles filogenéticos y evaluar similitudes entre especies¹⁴, permitiéndonos de esta manera categorizar una levadura dentro de un grupo o clados específicos. Por lo tanto, la construcción de árboles filogenéticos es una herramienta útil al momento de distinguir entre especies de interés clínico estrechamente relacionadas fenotípicamente, además de la evaluación de porcentaje de divergencia entre las secuencias de nucleótidos¹⁵. Se utiliza un porcentaje de divergencia entre las secuencias de nucleótidos para evaluar la similitud de las secuencias que pueda indicar con precisión que son taxones específicos. Este valor es ≤3% para indicar conespecificidad entre hongos, es decir, hasta 3% de divergencia de secuencia para asignar un nuevo nombre a una especie¹⁶.

Este estudio tuvo como objetivo evaluar la eficacia del análisis filogenético utilizando secuencias del gen ITS de aislados clínicos, recolectados entre 2018 al 2023, como una nueva herramienta diagnóstica para la categorización taxonómica e identificación especies que forman parte del complejo Candida parapsilosis.

Materiales y métodos

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Las levaduras fueron descongeladas del cepario de la Unidad de Investigaciones en Biomedicina de Zurita & Zurita Laboratorios. Se disponían de levaduras congeladas desde el año 2018 al 2023. No se dispone de aislamientos del año 2020. Se sembraron en medio cromogénico (medio CHROMagar™ Candida, BD™, Francia) y análisis micromorfológico en agar harina de maíz-Tween 80. El análisis colorimétrico automatizado mediante el sistema Vitek 2™ (bioMérieux, USA), mostró un perfil bioquímico típico de C. parapsilosis.

La identificación de las distantes especies de C. parapsilosis se realizó mediante ensayo de PCR utilizando el espaciador transcrito interno (ITS). Los productos de PCR fueron secuenciados por el método Sanger utilizando los mismos cebadores de amplificación (ITS1 e ITS4). Se construyó una matriz de alineamiento usando las secuencias de los aislados obtenidos y secuencias de referencia obtenidas de NCBI GenBank y Mycobank. Se utilizaron las respectivas matrices alineadas para la construcción de un árbol filogenético de Parsimonia Máxima (MP).

Para la prueba de sensibilidad se utilizó el método de microdilución en caldo con el sistema comercial Sensititre (Thermo Fisher Scientific, USA). Los antimicoticos ensayados fueron equinocandinas como anidulofungina, caspofungina y micafungina, los azoles como itraconzaol, voriconazol, posoconazol y fluconazol. Se ensayaron ademas anfotericina y 5-flucitosina.

Resultados

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Candida parapsilosis suele ser parte del microbioma del ser humano, los aislamientos que se congelaron desde el año 2018 corresponden netamente a las levaduras que estuvieron consideradas como agentes etiológicos de un proceso infeccioso. Se excluye el año 2020 en el cual no se congeló C. parapsilosis debido a la pandemia. Estos aislamientos corresponden a 84 individuos con una edad comprendida entre 0 meses a 96 años con una media de 36.8 años. Los pacientes de sexo masculino 47 (56%) fueron los más afectados. Las muestras cultivadas en las que crecieron estas levaduras fueron 20 (24%) de sangre, 18 (21%) de piel, anexos y tejidos blandos y 17 (20%) de oído. Los 29 orígenes restantes pueden observar en la Figura 1.

En la Figura 2 se encuentran las principales fuentes de aislamiento del complejo Candida parasilosis según grupo de edad. La candidemia fue una entidad clínica importante en el grupo de edad de menores de 1 año y en el grupo de adultos 20 a 65 años. La otitis fue importante también en este último grupo.

Análisis filogenético

El árbol filogenético resultante se muestra en la Figura 3. Se pudo observar la agrupación de las especies en dos clados monofiléticos principales. Un clado formado por las especies C. parapsilosis sensu estricto, que abarca la mayoría de las especies, mientras que el segundo clado, está formado por dos sublacos pertenecientes a las especies Candida orthopsilosis y Candida metapsilosis. La divergencia entre las especies C. parapsilosis sensu estricto y C. metapsilosis fue de 4.58%, entre C. parapsilosis sensu estricto y C. orthopsilosis fue 3.04%, y entre C. orthopsilosis y C. metapsilosis fue de 2.9%. El porcentaje de divergencia de las secuencias dentro de cada subclado fue bajo, con un valor inferior a 1%. De las 84 muestras analizadas usando el gen ITS, se llegó a la identificación a nivel de especie de todas las muestras, obteniéndose 74 (88.1%) aislamientos como C. parapsilosis sensu estricto 7 (8.3%) como C. orthopsilosis y 3 (3.6%) C. metapsilosis.

Tres aislamientos (3,54%) presentaron algun tipo de resistencia. Un aislamiento presentó resistencia a fluconazol, una fue resistente a fluconazol y 5-flucitosina y una mostró resistencia a voriconazol, fluconazol, anfotericina e intermedia a micafungina.

Discusión

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Durante la última década, la incidencia de Candida parapsilosis ha aumentado dramáticamente. De hecho, los informes indican que C. parapsilosis es a menudo la segunda especie de Candida más comúnmente aislada en hemocultivos y C. parapsilosis incluso supera a Candida albicans en algunos países europeos asiáticos y hospitales de América del Sur⁵.

Existen diferencias en la patogenia entre las especies del complejo de C. parapsilosis. C. parapsilosis sensu stricto, es considerada la especie más virulenta y con mayor capacidad para la formación de biopelículas. C. orthopsilosis es la segunda especie más virulenta dentro del complejo de C. parapsilosis8. Esta especie es capaz de formar biopelículas y de producir niveles más elevados de fosfolipasas y hemolisinas en comparación con C. metapsilosis y en algunos casos, incluso más que C. parapsilosis sensu stricto. Finalmente, C. metapsilosis es considerada la especie de menor virulencia, por lo tanto, de menor relevancia clínica. A pesar de que estudios que han demostrado su habilidad para formar biopelículas, la capacidad de adhesión y el daño tisular es muy baja¹⁷.

La susceptibilidad antifúngica dentro del complejo de C. parapsilosis difiere entre especies. De manera general, las especies del complejo son susceptibles a la mayor parte de los agentes antifúngicos y es característico de este complejo presentar concentraciones inhibitorias mínimas (CIMs) más elevadas a todas las equinocandinas, en comparación con otras especies de Candida18. Datos de susceptibilidad in vitro indican que C. parapsilosis sensu stricto es más resistente a fluconazol y equinocandinas que C. orthopsilosis y C. metapsilosis, siendo ésta última la especie más sensible19. Aunque las infecciones por C. parapsilosis generalmente producen tasas de morbilidad y mortalidad más bajas que las infecciones por C. albicans, se ha informado que varios aislados clínicos de esta especie son menos susceptibles a las equinocandinas y, en algunas regiones, también se ha observado resistencia al tratamiento con azoles, lo que complica la elección del tratamiento empírico con fármacos antimicóticos¹⁴. En nuestro estudio tres aislamientos de Candida parapsilosis sensu stricto presentaron resistencia. Un aislamiento fue resistente a fluconazol. Uno resistente a fluconazol, voriconazol, micafungina y anfotericina y un aislamiento mostró resistencia a fluconazol y 5-fluocitosina

Dentro del complejo, las especies muestran diferencias significativas en tasa de prevalencia. C. parapsilosis sensu stricto predomina en las unidades pediátricas y neonatológicas, situándose en ciertos casos por delante de C. albicans11. En general, la incidencia de C. orthopsilosis y C. metapsilosis es baja en comparación con la de C. parapsilosis sensu stricto. Sin embargo, en varios trabajos se ha encontrado que C. orthopsilosis ha sido aislada en mayor medida en áreas quirúrgicas. Entre ellos, Garcia-Effron et al., 2016, observaron que, en pacientes adultos, el cáncer estaba más asociado a C. orthopsilosis que a C. parapsilosis sensu stricto. Respecto a C. metapsilosis, su presencia en hemocultivos es muy baja, en concordancia con su menor virulencia, siendo más frecuente su aislamiento en mucosa vaginal u oído¹⁷. Datos similares fueron observados en a nuestro estudio.

Como ya se mencionó, la identificación de la especie de Candida por métodos bioquímicos y fenotípicos no pueden discriminar las especies del complejo de C. parapsilosis dado que las tres especies presentan las mismas características morfológicas y de crecimiento y los mismos perfiles de asimilación y fermentación de azúcares²⁰. La pirosecuenciación usando la región ITS2 y MALDI-TOF, han sido utilizadas para la correcta identificación de las especies del complejo. Esta última técnica permite, puede ser aplicada directamente en hemocultivos y disponen de sistemas que consisten en bases de datos de diagnóstico in vitro para un centenar de especies. Se ha comprobado que la técnica de MALDI-TOF permite identificar las especies crípticas del complejo de C. parapsilosis²¹. Sin embargo, en el año 2016, en un trabajo realizado en Francia, se comparó la exactitud de dos sistemas MALDITOF, el Vitek MS y el Microflex LT Biotiper, demostrando que este último sistema era capaz de identificar correctamente el 98% de los aislamientos de las tres especies mientras que el sistema Vitek MS identificaba correctamente todos los aislamientos de C. parapsilosis sensu stricto, pero identificaba erróneamente o no era capaz de identificar las especies C. orthopsilosis y C. metapsilosis. Por lo tanto, concluyeron que los resultados de los aislamientos identificados con el sistema Vitek MS deben ser nombrados como C. parapsilosis sensu lato21. Por lo tanto, las técnicas de secuenciación se han convertido en las gold estándar para la identificación de las especies del complejo C. parapsilosis, sin embargo, únicamente la secuenciación y el análisis mediante la comparación con bases de datos de NCBI GenBank para evaluar la identidad de una especie, no son suficientes para la discriminación correcta²². Es necesario realizar un análisis filogenético y análisis de divergencia, para poder categorizar e identificar estas especies estrechamente relacionadas. La divergencia intraespecífica encontrada en este estudio se corresponde bien con los datos disponibles en la literatura sobre la variabilidad intraespecífica de ITS del 0 al 3% en el reino fúngico²³, mientras que la divergencia interespecífica fue entre 2.9%-4.5%. Siendo C. orthopsilosis y C. metapsilosis, las especies más estrechamente relacionadas con 2.9%. El análisis filogenético nos permitió la identificación correcta de las tres especies cripticas del completo Candida parapsilosis (C. orthopsilosis, C. metapsilosis y C. parapsilosis sensu lato). La filogenética nos permite tener una mejor comprensión de cómo han evolucionado las especies y al mismo tiempo explica las similitudes y diferencias entre ellas, considerándose una de las mejores herramientas para comprender el origen y posterior evolución de especies. En este estudio presentamos una nueva herramienta diagnóstica, el análisis filogenético, para discriminar entre los miembros del complejo C. parapsilosis.

Los árboles filogenéticos construidos mostraron que todos los aislados de C. orthopsilosis, C. metapsilosis y C. parapsilosis sensu lato se agruparon, indicando un buen análisis de respaldo. Esta información puede ser útil para mejorar nuestra comprensión epidemiológica y diagnóstica.

Los resultados podrían proporcionar una referencia importante para futuros estudios sobre del complejo C. parapsilosis, incluidos estudios de identificación de especies y evaluaciones de prevalencia entre ubicaciones geográficas distintas. Lo más importante es que nuestra investigación será valiosa para una mejor clasificación e identificación del complejo C. parapsilosis con el fin de desarrollar estrategias adecuadas de prevención y control de propagación.

Conclusiones

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La construcción de árboles filogenéticos mediante el análisis de similitudes entre las secuencias de la región ITS de los aislados en este estudio, es una nueva alternativa para la diferenciación entre especies estrechamente relacionadas fenotípicamente que no se las puede identificar usando metodos colorimetricos como en el Vitek 2™ ni metodos proteomicos como el MALDITOF, La construccion de árboles filogenéticos mejora el diagnóstico y la epidemiología de las especies del complejo Candida parapsilosis Los patrones de sensibilidad no mostraron mayores diferencias entre las especies cripticas. Un enfoque futuro de investigación en las especies de este complejo debe ser encaminada a investigar las condiciones predisponentes y los factores de riesgo, así como los factores de virulencia para una mejor comprensión de la identificación de estas especies. La utilización del ensayo de PCR utilizando ITS, es una metodologia que podria ser integrada a la rutina de diagnóstico microbiológico cuando el laboratorio cuente con un secuenciador.

Conflicto de intereses

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.